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Clinacanthus nutans提取物具有抗氧化作用,對人體癌細胞系具有抗增殖作用- PubMed - NCBI

抽象

Clinacanthus nutans林道葉(CN)已用於傳統醫學,但其治療潛力尚未探索用於癌症預防和治療。目前的研究旨在評估在氯仿,甲醇和水中提取的CN對癌細胞系的抗氧化和抗增殖作用。使用DPPH,galvinoxyl,一氧化氮和基於過氧化氫的自由基清除測定評估CN的抗氧化性質,然而在HepG2,IMR32,NCL-H23,SNU-1,Hela,LS-174T,K562,Raji上測試殺腫瘤效果和使用MTT測定的IMR32癌細胞。我們的數據顯示CN在氯仿提取物中是抗DPPH和galvinoxyl自由基的良好抗氧化劑,但是否定一氧化氮和過氧化氫自由基的效果較差。氯仿提取物對K-562具有最高的抗增殖作用(91.28±0。 μg / ml和其他五種癌細胞係以濃度依賴性方式,但不在IMR-32細胞上。在氯仿提取物中鑑定了14種已知化合物,其通過氣相色譜 - 質譜分析進行分析。總之,CN提取物具有抗培養的癌細胞系的抗氧化劑和抗增殖特性,表明用於癌症預防或治療的替代輔助療法。

1.介紹

癌症仍然是馬來西亞人口面臨的主要健康威脅之一。統計數據顯示,馬來西亞衛生部醫院癌症患者的年死亡率自2006年以來一直達到10-11%[ 1 ]。越來越多的證據表明,腫瘤發生密切與升高水平的細胞內自由基的相關聯,所述活性氧/氮物種(RONS),其引發癌症引發和進展[ 2 - 4]。RONS通常作為正常細胞中的代謝副產物產生,並且在氧化還原介導的信號傳導中具有不可缺少的作用。然而,RONS水平需要通過氧化還原穩態來保持基礎RONS低於細胞毒性水平。不受控制RONS生產壓倒內源性抗氧化能力會導致細胞蛋白,脂質和DNA有害損傷,導致基因組不穩定性,並最終促進癌症的形成[ 5 - 7 ]。有證據表明癌基因激活,增加的代謝活動和線粒體功能障礙是導致細胞RONS水平顯著增加的常見原因[ 8]。因此,用抗氧化劑補充劑清除RONS可以挽救細胞免受氧化應激,並防止癌症的生長和擴大。這種益處也見於患有乳腺癌風險的患者,他們通過服用抗氧化劑補充劑(如類胡蘿蔔素)而免於疾病[ 9 ]。隨著癌症研究的進展,許多分子靶向藥物已被引入,並顯示出有希望的結果,副作用小。然而,使用也受到某些癌細胞中基因組不穩定性和耐藥特性的限制。因此,由於其多靶點特性,已將興趣轉向研究傳統草藥作為替代性抗癌療法。因此,我們試圖評估Clinacanthus nutans林道有望被用作癌症預防和治療的天然保健品。Clinacanthus nutansLindau(CN),也被稱為沙巴蛇草,來自Acanthaceae科,是泰國民間傳說醫學中一種著名的藥用植物。此前,CN歷來被用於治療炎症[ 10 ]和病毒感染[ 1112 ]。這種草藥的使用也被翻譯成泰國的皰疹感染診所[ 13 ]。CN氯仿提取物的​​葉綠素衍生物(phaeophytins)含有13個2-羥基 - (13 2 - R) - 脫鎂葉綠素b,13個2-羥基 - (13 2S) - 脫鎂葉綠素a和13 2-羥基 - (13 2 - R) - 脫鎂葉綠素,並表現出抗皰疹單純活性[ 14 ],可能通過皰疹病毒滅活和抑制預感染[ 15 ]。儘管以前的工作中已知的所有生物學活動,新興的證言和馬來西亞的報紙報導表明CN具有抗腫瘤作用,並拯救了許多種癌症。然而,這些證詞沒有得到科學證據的支持。我們推測CN衍生物可能是基於細胞保護性抗氧化劑的抗癌療法的來源。因此,本研究的主要目的是研究C. nutans的抗氧化作用和細胞毒性作用 在癌細胞系上。

2.方法和材料

2.1。化學製品

1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH)基團,galvinoxyl基團,6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯並二氫吡喃-2-羧酸(Trolox),磷酸鹽緩衝鹽水(PBS),台盼藍,3 - (4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)和10x胰蛋白酶-EDTA溶液購自馬來西亞Sigma化學有限公司。過氧化氫和硝普鈉(SNP)購自馬來西亞默克。所有的癌細胞系包括人肝細胞肝癌(HepG2),人神經母細胞瘤細胞系(IMR-32),人肺癌細胞系(NCI-H23),人胃癌細胞系(SNU-1),人結腸腺癌細胞系(LS-174T),人紅白血病細胞系(K-562),人宮頸癌細胞系(HeLa)和人伯基特氏淋巴瘤細胞系(Raji)購自美國典型培養物保藏中心(ATCC,

2.2。植物材料

Clinacanthus nutans(Burm.f.)Lindau 的整株植物於2011年11月從馬來西亞雪蘭莪Serdang的植物園收穫。C. nutans的植物鑑定特徵為馬來西亞太子大學生物科學研究所植物標本館,雪蘭莪州(證件號SK1980 / 11)。

2.3。提取物的製備

所述C.垂穗葉新鮮收穫並在40-45℃的烘箱中乾燥。然後將葉子研磨成粉末並在室溫下依次浸入氯仿(CNC),甲醇(CNM)和蒸餾水(CNA)中。所有三種溶劑中的提取物分別收集在乾淨的玻璃瓶中。然後使用Whatman no。過濾提取物。1篇論文。氯仿和甲醇中的濾液用旋轉蒸發器乾燥,蒸餾水中的濾液用冷凍乾燥器乾燥。所有提取物保持在20℃直至使用。

2.4。抗氧化性能的測定

2.4.1。DPPH自由基清除試驗

根據Chan等人描述的方法測定測試提取物的DPPH自由基清除活性。[ 16 ]稍作修改。簡言之,各提取物溶液(50  μ L),之後在連續乙醇稀釋至12.5,25,50,和100  μ克/毫升,用195混合  μL的DPPH乙醇溶液(0.2mM)。然後,將混合物輕輕旋轉1分鐘並在黑暗中保持60分鐘。每種提取物的DPPH自由基清除活性通過電子自旋共振譜(JEOL-JES-FA100,日本東京)使用以下參數測定:清掃場,340.047±5mT; 微波功率,4 mW; 調製寬度,0.1 mT; 掃描時間30秒; 時間常數,0.1秒; 振幅為160.以Trolox作為標準,每種提取物的DPPH自由基清除活性表示為μg Trolox當量/ g提取物。

2.4.2。Galvinoxyl清除自由基的活性

為了確定每種提取物的galvinoxyl自由基清除活性。萃取物連續稀釋至12.5,25,50,和100  μ克/毫升溶液在乙醇中,他們每個人(50  μ L)與150混合  μ升加爾萬氧基自由基乙醇溶液(0.125毫摩爾)。然後,將混合物輕輕旋轉1分鐘並在黑暗中保持60分鐘。通過電子自旋共振波譜法(JEOL-JES-FA100,日本東京)使用以下參數測定每種提取物的Galvinoxyl自由基清除活性:清掃場,340.047±5mT; 微波功率,4 mW; 調製寬度,0.2 mT; 掃描時間30秒; 時間常數,0.1秒; 振幅為120.以Trolox為標準品,每種提取物的galvinoxyl自由基清除活性均為μ克Trolox當量/克的提取物。

2.4.3。一氧化氮(NO)自由基清除試驗

硝普鈉(SNP)在生理pH(pH 7.4)下通過與水溶液中的氧相互作用自發產生一氧化氮(NO)。NO清除劑最終會減少溶液中亞硝酸根離子的產生,這可以通過使用Griess試劑來確定。簡言之,將每個提取物(50  μ不同濃度的L)(12.5,25,50,和100  μ克/ mL)與等體積的SNP的(10mM終濃度),在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)混合,並在溫育室溫下150分鐘[ 17]。在不含提取物的蒸餾水中的DMSO(0.1%)作為陰性對照,並將槲皮素用作陽性對照。溫育後,將上述樣品與等體積的Griess試劑(1%sulphanilamide,0.1%萘基乙二胺二氯化物和3%磷酸)反應。在550nm處測量反應中形成的髮色團對相應對照的吸光度。亞硝酸鹽的樣品中的量從亞硝酸鈉的標準曲線(0-100計算  μ M)。

2.4.4。過氧化氫的清除活性

按照Ruch等人的方法,測試了C.curpentin葉片的所有三種提取物對過氧化氫的清除潛力。[ 18 ]。簡言之,將樣品提取物(2mL)中的不同濃度(12.5,25,50,和100  μ克/毫升)中的溶液與過氧化氫混合(H 2 ö 2)溶液(1.2毫升,40毫摩爾)在磷酸鹽緩衝液(pH7.4 )。將混合物溫育10分鐘,並在230nm測量吸光度。等體積的不含H 2 O 2的蒸餾水作為空白。每個提取物的清除活性是通過使用下式計算如下:%清除活性= [( Ç -  )/ A c ]×100,其中A c表示對照的吸光度,A t表示提取物的吸光度。

2.5。細胞培養

三種不同的萃取物八人癌細胞系,包括人肝肝細胞癌(肝癌),人成神經細胞瘤細胞系(IMR-32),人肺癌細胞系(NCI-H23),人胃癌細胞株(SNU-測試1),人結腸腺癌細胞系(LS-174T),人紅白血病細胞系(K-562),人宮頸癌細胞系(HeLa),人伯基特氏淋巴瘤細胞系(Raji細胞)和正常細胞,和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的抗增殖活性。所有的細胞系保持在RPMI 1640或DMF含10%補充有青黴素(100U / mL)和鏈黴素(V / V)胎牛血清(FBS)(100  μ除了在補充有低血清生長補充物的M200中在37℃ 和在培養箱中含有5%CO 2潮濕氣氛下生長的HUVECs之外。

2.6。抗增殖測定

採用MTT法檢測三種提取物的抗增殖活性[ 19 ]。簡言之,將細胞(6×10 3  細胞/ mL)於96孔,平底板接種,並在從3.125至100的濃度範圍內具有三個不同提取物處理  μ克/毫升後細胞在37℃溫育加濕5%CO 2 /95%空氣混合物過夜。治療後的72小時,20之後  μ升0.5%3(4,5-二甲基-噻唑-2-基)在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)溶液加入到每個孔中並培養在5%CO 2額外4小時加濕培養箱。將平板以3000rpm離心10分鐘並除去上清液。在每個孔中的甲臢晶體加入100溶解  μ大號二甲亞砜(DMSO)的。通過用微孔板分光光度計讀數器在550nm處測量吸光度來測定相對於活細胞數量產生的紫色甲amount的量。對於CN處理的細胞,存活力表示為對照細胞的百分比。所有測定一式三份進行,並進行三次獨立測試。所有提取物以終濃度小於0.1%溶於DMSO中。在這些條件下,DMSO對上述所有癌細胞系均無毒性。

2.7。GC-MS分析

CNC通過配備質譜的氣相色譜(GC-MS-QP2010 Plus-Shimadzu)進行分析。柱溫設定為50℃4分鐘,然後以7℃/分鐘的速率升至320℃,然後保持20分鐘。(:1,注射體積= 0.1與比例分割模式被調節至20所述的噴射器溫度設定在280℃  μ L)。氦載氣的流量設定為1mL / min。總運行時間為60分鐘。質譜由m / e 40至700 的範圍和70 eV的電子電離獲得。樣品的色譜圖通過比較其質譜與NIST08文庫數據以及相對於已知標準的GC保留時間來鑑定。

2.8。統計分析

所有數據均以均數±標準誤差(SEM)表示,並使用社會科學統計軟件包(SPSS 16)進行。數據通過單因素方差分析進行分析,然後進行Dunnett's檢驗。P <0.05被認為是顯著的。

 

3.結果

3.1。DPPH自由基清除活動

DPPH已被廣泛用於測量各種樣品(包括水果,飲料,甚至植物提取物)的抗氧化性能。在目前的研究,水溶性維生素E作為標準,並因此提取物的抗氧化能力將被表達μ克TEQ / g的提取物。圖1示出了CNC被發現表現出相比CNM和CNA最高DPPH自由基清除活性用抗氧化劑容量值,7852.63±449.90  μ克TEQ / g的提取物。然而,CNA顯示出與抗氧化能力值864.11±73.49最低活性  μ克TEQ / g的提取物。所述的抗氧化活性C.鹼草提取物在氯仿>甲醇>水溶液的順序降低。

Clinacanthus nutans葉片各種溶劑提取物的DPPH和galvinoxyl自由基清除活性。結果代表平均值±SEM(n = 3)。

3.2。Galvinoxyl清除活性

連續提取C. nutans的 Galvinoxyl自由基清除活性以相同的DPPH方式評估,其中Trolox用作標準,並且通過使用ESR光譜測量吸光度。圖1顯示了三種類型提取物的galvinoxyl自由基清除活性。氯仿萃取物用具有±12248.82 173.50的值最高的清除活性  μ克TEQ / g的提取物。此外,觀察到類似的順序,其中galvinoxyl自由基清除活性的順序是氯仿>甲醇>水溶液。

3.3。一氧化氮清除活性

圖2顯示了三種不同的 C. nutans葉提取物的一氧化氮(NO)清除活性。據觀察,只有CNA具有清除一氧化氮自由基的能力,並且呈濃度依賴性。使用100觀察到的32.33±0.97%的最高NO清除活性 μ CNA的克/毫升。亞硝酸鹽含量在CNM是顯著更高,在100  μ克/毫升的18.51±8.24%的NO清除活性。

不同濃度的不同溶劑中一氧化氮自由基對C. nutans提取物的清除活性百分比。反應一式三份進行,結果以%抑制(平均值±SEM)表示。

3.4。過氧化氫清除活性

在這項研究中,CNC,CNM,和CNA表現出相對差的過氧化氫的清除活性,儘管CNM是最有效的過氧化氫清除劑,其表現出〜100 34%清除活性  μ克/毫升(圖3)。

抑製過氧化氫自由基。數據代表過氧化氫自由基抑制的百分比(平均值±SEM),並且實驗一式三份進行。

3.5。C. nutans提取物對腫瘤細胞生長的抗增殖作用

  1. nutans提取物對人肝細胞肝癌(HepG2),人神經母細胞瘤細胞系(IMR-32),人肺癌細胞系(NCI-H23),人胃癌細胞系(SNU-1)的抗增殖活性,人結腸腺癌細胞系(LS-174T),人紅白血病細胞系(K-562),人宮頸癌細胞系(HeLa)和人伯基特氏淋巴瘤細胞系(Raji)如表1所示。細胞增殖的抑制顯著示於HeLa和K-562細胞用經處理後C.垂穗在100提取含水 μ克/毫升(36.31±1.52%和40.94±0.19%,RESP)其它的,但不是。C. nutans的甲醇提取物對四種癌細胞系,即NCI-23,HeLa,K-562和Raji細胞系沒有表現出活性。CNM顯示相對弱的抗增殖活性在IMR32,SNU-1和LS-174T細胞系中,儘管在HepG2細胞系中觀察到,在100±41.88 2.81%的抑制 μ克/毫升展出。對於在該實驗中測試的大多數癌細胞系,CNC是最有效的抗增殖劑。CNC顯示對K-562和Raji腫瘤細胞系的最高抗增殖活性,在100  μ克/毫升的抑制百分比的91.28±0.03%(IC 50 = 47.70  μ克/毫升)和88.97±1.07%(IC 50 = 47.31  μ分別為g / mL)。然而,在IMR 32細胞系中未觀察到效果。

表格1

氯仿,甲醇和水提取物的抗增殖作用下垂穗以各種濃度(3.125-100  μ克/毫升)上八種不同類型的致瘤細胞系和正常細胞,人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的。將生長抑制活性標準化為對照,並以百分比(%)表示。數據以平均值±SEM表示,一式三份。

為了測試提取物是否是細胞毒性對正常細胞,人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在最高試驗濃度,這是100與所有CNC,CNM,和CNA處理  μ克/毫升。與其他癌細胞相比,HUVEC中的抑制百分比顯著降低(P <0.05)(表1)。

3.6。氯仿提取物的​​GC-MS分析

C. nutans的氯仿提取物進行GC-MS分析與甲醇和水溶液中的提取物相比,其在抗氧化和抗增殖方面表現出相對較高的活性(圖4)。鑑定了14種化學成分,主要化學成分是1,2-苯二甲酸,單(2-乙基己基)酯,相對峰面積為28.60%(表2)。以前的報導表明,1,2-苯二甲酸,單(2-乙基己基)酯具有抗微生物活性[ 20 ]。這些植物化學物質也可能有助於藥物活性,包括抗氧化和抗增殖特性。

4。討論

過去的研究表明,不平衡的細胞氧化還原穩態與自由基生成的增加是癌症發生和發展以及許多其他疾病的常見原因之一[ 21 ]。癌細胞中自由基,活性氧和活性氮物質的增加與腫瘤發展的快速進展和促進轉移相關,這通常導致預後不良。目前對癌症患者的治療,例如化學療法和放射療法,也可能導致對腫瘤細胞以及相鄰健康細胞的氧化損傷。許多臨床試驗還表明,抗氧化劑可以保護健康細胞免受這些療法誘導的氧化應激,最大限度地減少癌症患者隨後的副作用[ 22]24 ]。因此,用抗氧化劑清除自由基可能是保護正常健康細胞免受DNA損傷並限制癌細胞進展的另一種策略。然而,越來越多的證據表明,在一些轉化的癌細胞中可能會出現對極端氧化應激的適應[ 25 ]。這些癌細胞可以開發具有增強的清除能力的抗氧化防禦系統,並通過上調存活蛋白來維持內在的ROS毒性。例如,H-ras轉化的細胞具有增加的超氧化物和過氧化氫水平,注意到抗氧化酶peroxiredoxin-3和硫氧還蛋白過氧化物酶顯著上調[ 26]]。這種效應可能使癌細胞能夠逃避ROS介導的細胞凋亡。因此,單獨用外源抗氧化劑清除自由基可能不能有效消除轉化的癌症。此外,發現癌細胞中升高的ROS水平通過過氧化氫(H 2 O 2)的細胞間轉移影響鄰近細胞以獲得不受控制的ROS產生[ 27 ] 。因此,仍然需要抗氧化劑來阻止ROS擴散,並且其作用更可能挽救與轉化的癌細胞相鄰的未受影響的細胞並限制腫瘤擴增。

因此,引入多靶點治療的概念以利用單一方案來發揮複雜的協同和拮抗作用以作用於多種病理生理途徑以實現最佳治療結果。Clinacanthus垂穗(CN)葉先前已經已知具有抗炎[ 28 ]和抗病毒特性[ 2930 ]。Pannangpetch等人最近的報告。[ 31 ]還記載了C. nutans的乙醇提取物葉片具有抗氧化活性和對氧化溶血的保護作用; 然而,該研究尚未擴展到研究其抗腫瘤特性。在這裡,我們檢查了在三種不同溶劑中提取的CN的影響:氯仿,甲醇和水。在對二苯基-1-苦基肼(DPPH),galvinoxyl自由基,一氧化氮和過氧化氫清除測定進行測試後,我們觀察到CN含有抗氧化元素並且能夠抵消自由基,儘管具有不同的CN提取物。然而,DPPH的結果與一氧化氮清除試驗的數據相矛盾。這可能歸因於提取物在不同測試系統中的溶解度,並且自由基的立體選擇性也可能有助於提取物的不同抗氧化活性[ 32]。

來自癌症患者的新證詞表明,草藥可以消除這種疾病,這表明它們可能用於抗癌治療。我們的實驗證明,CN,特別是氯仿中的提取物,能夠抑制7種受試癌細胞系的細胞增殖,即HepG2,IMR32,NCL-H23,SNU-1,HeLa,LS-174T,K562和Raji。細胞。儘管CNC中的成分未能抑制IMR32癌細胞的增殖,但仍然可以使用甲醇和水中的提取物觀察到抑製作用。在CNC處理K562細胞和Raji細胞中,IC 50值分別為47.70  μ克/ mL和47.31  μ克/毫升,落入推薦IC以上50由國家癌症研究所(NCI),用於粗提取物,其是<20值  μ克/毫升。雖然這些數據表明CNC可能不是一種強有力的抗癌方案,但本實驗中證明的抗氧化劑和癌症抑制特性仍然可以支持使用CNC作為癌症預防或治療的替代輔助療法。GC-MS分析顯示了CNC的揮發性成分,顯示了14種不同濃度的植物化學物質,其中1,2-苯二甲酸,單(2-乙基己基)酯是提取物中含量最多的,是一種常見的增塑劑,被發現具有抗菌活性[ 33 ]。仍需要進一步的研究來揭示負責觀察活動的潛在機制和特定的生物活性化合物植物化學物質。

5.結論

總之,C。nutans葉子的氯仿提取物含有最有效的成分,能夠清除自由基並抑制培養的癌細胞系的生長。該觀察結果表明,氯仿提取物中存在的植物化學成分可用作具有癌症風險的患者的替代輔助或化學預防方案。然而,需要進一步的研究以了解觀察到的抗腫瘤活性的潛在機制和體內測試,以揭示其在癌症治療中的潛在用途。

 

作者信息 :

Yoke Keong Yong, 1 Jun Jie Tan, 2 Soek Sin Teh, 3 Siau Hui Mah, 3 Gwendoline Cheng Lian Ee, 3 Hoe Siong Chiong, 1 和 Zuraini Ahmad 1,*

 

1馬來西亞Putra大學醫學與健康科學學院生物醫學科學系(UPM),馬來西亞

UPM Serdang 43400

2馬來西亞Universiti Sains高級醫學和牙科研究所,馬來西亞檳城13200 Kepala

Batas

3馬來西亞Putra大學理學院化學系(UPM),馬來西亞UPM Serdang 43400

* Zuraini Ahmad:ym.ude.mpu.cidem@iniaruz

學術編輯:JoséLuisRíos

 

發表時間 :

基於Evid的補充Alternat Med。2013; 2013:462751。

在線發布2013年2月27日 doi:  10.1155 / 2013/462751

 

資料來源 :

美國國家醫學圖書館 /國家衛生研究院PubMed - NCBI數據庫

PMCID:PMC3600186

PMID:2353348

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3600186/

 

 

 

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